流動相的pH和緩沖液離子濃度對分離和色譜保留的影響
發布日期：2014-07-08
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用反相色譜分離酸性或堿性組分要求流動相為酸性或堿性，或者加入緩沖液。酸、堿和緩沖液的概念是一致的，但在HPLC的流動相中加酸、加堿的作用和加緩沖液的作用有些不同。
反相色譜的固定相是以烷烴鏈為主的非極性鍵合相，加十八烷基硅烷（C18），對非極性組分保留時間長，對極性組分保留時間短。
流動相的pH＜7時，酸性分為游離型（RCOOH），極性小，堿性組分為離子型（RNH3.C1），極性大。酸性組分在色譜柱上保留時間長，能充分在固定相和流動相之間多次分配，使用權得組分彼此間得以分離，增加組分的選擇性。
若流相的pH＞7時，堿性組分為游離型（RNH2），極性小，酸性組分為離子型（RCOO-Na），極性大。有利于堿性組分的分離。
所以在分離酸性組分時流動相的pH＜7，在分離堿性組分流動相的pH≥7。
分析帶有竣基（—COOH）的次甘草酸，用的是典型的反相HPLC，隨著流動相的pH值減小，保留不斷加大。
單純用酸或堿調節流動相的pH值是比較極端的情況，除非混合樣品中的組分是清一色的酸性組分或是清一色的堿性組分，一般不單加酸或單加堿。通常要分離的組分性質是多種多樣的，必須采用緩和的、經得直沖擊的緩沖液流動相。
HPLC常用的緩沖液是由下列三類緩沖物質對配制的：乙酸、乙酸鈉（pH=3～6）；磷酸-磷酸鹽（K+，Na+）pH=2～8）；三羥甲基氨甲烷（Tris）-GC1（pH=7～9）。
磷酸-磷酸鹽系列是硬酸鹽，與有機溶劑（甲醇、乙腈）混合時容易析了出不易看到的細微晶體。過濾掉，流動相的組成改變。不過濾，晶體傷泵、傷進樣器、傷柱、傷檢測器。如能滿足實驗條件，先選用軟酸鹽（乙酸鹽、Tris系列）。
用緩沖液千萬不要忘記沖洗干凈。
一些離子型的組分在無緩沖液的流動相中會離解生成H+或OH-，組分在柱內形成譜帶的那一部分引起流動相pH的變化，對色譜的分離產生影響。流動相內加了緩沖液使pH值的在一個范圍內還會變化，而且應變力是強大的，小小的組分離解引pH值的變化，而且應變力是強大的，小小的組分離解引起pH值的變化不足以改變整個流動的pH值。
例如分析一組酸性組分的樣品：萘磺酸、腎上腺素、苯甲醇、去甲變腎上腺素。這些組分有的酸性強，有的酸性弱，有的呈兩性。還是采用C18柱，磷酸鹽沖液-甲醇為流動相，如果緩沖物質對的濃度過低，4個組分間的分離差，色譜峰嚴懲揚長拖尾。提高緩沖液的沖物質對濃度上述缺點得到克服。
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