液相色譜技術的發展歷程

　　色譜的發明者，俄國植物學家M.S.Tswett，是在研究植物色素的過程中，于1906年創立這種簡易的分離技術，奠定了傳統色譜法基礎。從此之后，化學家、生物化學家和生理學家們在制備高純化合物、分離和鑒定復雜混合物時便有了一條嶄新的有效途徑。自從有了這種手段，使許多過去被認為是單一的物質，判明卻是多種化合物的混合物；許多化學反應的過程依靠這種方法而得以探討；終于使許多復雜混合物，例如維生素、藥物、色素、氨基酸等得到離析；這種方法甚至幫助科學家們了解了一些長期模糊不清的自然現象，諸如植物與動物的營養、激素對人和動物的生理特性、維生素在動植物體中的分布等等問題。Tswett的實驗意義很大，盡管他于1907年在德國柏林植物學會議上反復強調色譜技術，但并沒有受到當時科學界的重視。經過二十五年后，德籍奧地利化學家R.Kuhn等利用他的方法在纖維狀氧化鋁和碳酸鈣的吸附柱上將過去一個世紀以來公認為單一的結晶狀胡蘿卜素分離成a和b兩個同分異構體，并由所取得的純胡蘿卜素確定出了其分子式。另外他還發現了八種新的類胡蘿卜素，并把它們制成純品，進行了結構分析。同年，他又把注意力集中在維生素的研究上。在確定了維生素A的結構以后，于1933年從35000升脫脂牛奶中分離出一克核黃素(即維生素B2)，制得結晶，并測定了它的結構。此外，他還用色譜法從蛋黃中分離出了葉黃素；還曾把腌魚腐敗細菌中所含的紅色類胡蘿卜素確定離析出來并制成結晶。Kuhn正是由于在維生素和胡蘿卜素的離析與結構分析中取得了重大研究成果而獲得了1938年諾貝爾化學獎，也正因為他的出色工作使色譜法名聲大振，迅速為各國科學家們所注目，廣泛被采用起來。
　　
　　1液相色譜固定相、
　　
　　1.1正相色譜八十年代初，人們使用的正相色譜固定相硅膠和吡啶硫氰酸鎳鹽的絡合物晶體能與芳香族化合物形成包合物用于分離芳香族含氮異構體和膽甾醇晶體。已有人[1]將焦炭吸附劑作為填料和鍵合硅膠作過比較并研究其熱力學機理。具有離子化或非離子化功能團的大孔聚合物也開始應用于液相色譜，這些聚合物在整個酸堿范圍內穩定，其中一個缺點是當溶劑改變時，它們會熱脹冷縮，但是其主要的分析方面用途，即從水中收集痕量研究化合物是沒有問題的，通過適當的處理裝入色譜柱，一些物質出現過度的峰帶變寬，而另一些則出現尖、窄的峰帶和高分離度，在強堿性大孔樹脂中120分鐘內可分離100種尿液中紫外吸收物質[2]。有人將各種鏈長度的碳氫配位體鍵合到硅膠上，根據鏈長短效應研究保留值的影響，也有過類似的報道，將C22鍵合相以及制備鍵合相擔體各種條件作過比較，其鍵長度和吸附自由能成線性關系。一般地，堿溶液會破壞硅膠，烷基胺比季銨鹽更會腐蝕硅膠填料，故通過加填有5mm硅膠的短預柱來洗脫堿性溶液。Kataev等[3]用聚三氟苯乙烯涂成的硅膠微粒基質并應用到鹵代芳烴、多肽和蛋白質的分離。1993年11月，Majors討論了在日本發展迅速的HPLC聚合物填料。Hosoya制備了大孔聚合乙烯—對—叔丁基苯甲酸丁酯微球和兩種別的聚合物微球的性能以及更多的C18HPLC固定相。
　　
　　1.2反相色譜固定相的研究進入九十年代更是熱火朝天。這方面的研究報道遠遠超過流動相的研究，人們不斷探索保留過程及相關烷基鍵結構的復雜性和可能制得的各種新型固定相。Bolok和其合作者從統計技術研究反相色譜柱的老化過程。Montes等評價了一種硅氫化物介質的硅氫烯制備烷基鍵合相，更早時候基質制備可供參考。Moriyama等評價了用2mm硅膠制得的TSK膠SuperODS新型反相色譜柱的特性，他們論述了如何分離手性化合物。Schmid與合作者論述了含飽和脂肪酸鍵合相的合成與性質，并且與相應的飽和烴固定相的使用作過比較。Pesek和Matyska合成了兩種不同的二醇鍵合相，包括一種是“可靠的”，另一種通過將7－辛烯－1，2－二醇直接連接到氫化硅基質上。Jino和Nakamura[4]評價了用氟處理的鍵合硅膠作為一種反相色譜基質與常規反相色譜基質的選擇性不同。Buszewki等比較了烷基胺和烷基鍵合相基質用于反相分離，發現前者對分離極性化合物效果顯著，但其熱穩定性不如后者。Wongyai用苯丙醇胺鍵合到硅膠上產生離子交換——反相基質的混合模型，并且評價了酸性系列、中性和堿性物質的分離效果。Friebe將Calixarene鍵合到硅膠上研究其作為選擇相能夠形成類似于環糊精的內包合物。Chriswanto和伙伴們將聚吡咯相涂在硅膠上作為HPLC的特征化填料。Ge等合成了聚3－辛環吡咯改性硅膠，評價其作為蛋白質的分離及探討酸、堿介質的穩定性。Skapo和Simpson則在流動床中制得反相基質，他們總結出在有機溶劑中通過這種途徑與常規鍵合相比較可制得重現性更好的基質。Theinpont論述了在HPLC柱中已經填裝好的硅膠的衍生化過程和通過這種途徑制得的色譜柱和常規鍵合相色譜柱進行了比較。
　　
　　1.3親和色譜日本和歐洲較多研究多孔聚合物在液相色譜中的應用，這些聚合物可用于分離各種芳香族化合物和糖類，高分子填料對保留值有較大影響，依據不同溶劑洗脫次序，可估算出聚合物溶解度參數。它們適用于親水溶質排阻色譜，如有一種吸附劑TSK-SW硅膠帶有親水鍵合相，在較大的流速下能經受高壓且有非常高的分離度，尤其適用于蛋白質和腐殖酸的分離。曾有人描述過帶羥基、氰基、銨離子及芳基金屬醚鍵合到硅膠上，銨離子鍵合相主要以氫鍵結合，通過溶劑作用穩定保留值。
　　
　　1.4離子交換色譜離子交換固定相的確研究過不少，如八十年代初流行的TSK型SW硅膠及基于二乙胺乙基(DEAE)制成的陰離子交換材料用于蛋白質及核酸的優化分離，低聚糖的分離采用Micro-PakAX-5。XAD樹脂是色譜中使用基本的固定相，弱酸、弱堿及兩性電解質的分離均有人研究過，反離子以擴散雙電層形式存在。也有人制備多孔甲基丙烯酸鹽離子交換劑，但多數人愿意使用商品化的交換劑。Sevec和Frechet[5]制得聚甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚二甲基乙烯丙烯酸酯色譜柱(300×8mm)用于蛋白質離子交換的制備色譜。他們能做到一次進樣到這種色譜柱分離300mg的蛋白質混合物。Gawdzrk和Matynia制備了一種交聯的(p,p’—二羥基苯)—丙烷二環氧甘油醚和二乙烯苯的甲基丙烯酸酯的多孔共聚物作為一種較新的HPLC填料并且評價了其作為正相和反相分離的效果。Danielson和其合作者[6]用一種丙胺基硅基質同Kel-F800反應制得一種弱陰離子交換填料。
　　
　　1.5空間排阻色譜Kato等曾通過丁醚或三乙醇苯醚與TSKG3000SW空間排阻色譜法(SEC)結合合成HIC固定相材料，當使用鹽溶液梯度洗脫時，可達到很高的分離度。一些極性鍵合相通過分配比調節的排阻色譜分離蛋白質和多肽。Miller等報道過用醚相結構合成大孔硅膠填料：Si-(CH2)3-O-(CH2CH2O)n-R;n=1,2或3;R=Me,Et或n-Bu。用這種填料制得的色譜柱可至少連續使用五個月其保留值不變。
　　
　　烷基鏈長度和配體密度能直接影響到保留值與分離度，而使用低配位數密度基質更易再生，不易變性，對分離大多數蛋白質來說，基質微球直徑在300Å時具有最強的再生力，直徑小到1mm的多孔微粒填入1cm的色譜柱中對于蛋白質的分離十分有用。另一改進色譜有效途徑是使用非多孔微球(1-3mm)，柱長約30mm，柱效穩定，當小心控制流動相溫度和所有儀器組成時，柱外效應很小，曾有人通過洗脫法在2分鐘內分離6種蛋白質的混合物。
　　
　　Smigol[7]論述了均相聚合甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚乙烯二甲基丙烯酸酯微球用特殊化功能的多孔介質制得二醇或二乙胺相有較大孔隙和十八烷基官能團有較少孔隙，這樣制得的一種基質當所有分子接近極性相時，較少的分子進入多孔介質，而限制了大分子進入到十八烷基鍵合相中。
　　
　　總之，不論是何種類型的固定相對于手性異構體的拆分以及蛋白質和多肽大分子的分離仍在不斷的探索完善之中，從發展的趨勢看，尋求各種高分子材料作為新型色譜固定相前景光明。
　　
　　2液相色譜流動相
　　
　　液相色譜應用廣泛的是反相色譜，其流動相的優化組合直接關系到分離效果。八十年代二元流動相組成優化依賴于容量因子(k’)的對數值與極性溶劑的摩爾分數關系，根據兩者線性關系，可以估算溶質的保留值。曾有人確定過14種二元溶劑系統的容量因子與流動相的關系。
　　
　　Scott,Snyder和Soczeuinski的色譜模型被應用于分離烷基酚和萘酚，使用mBondapakNH2固定相，Nurok和Richard建立了一個簡單的方程來確定溶劑組成的優化，這種方法既可以用于TLC也可以用于HPLC。六種等離子強度溶劑的結合被應用于產生六種三元流動相，用于分離大范圍的化合物，這些混合物的極性通過增加極性溶劑來調節。Zima和Smolkova報道過在碳吸附劑上氨基酸保留值的酸堿效應及離子強度，并且給出一系列方程式預言這些兩性電解質的保留行為。Markl曾將有機磷和硫加入到流動相中可以調整硅膠表面，這些化合物吸附在硅膠表面由于氫鍵作用而改變了選擇性和溶質的保留值。Hitachi化學公司用于二甲基乙烯酰胺和二甲基聚丙烯酰胺流動相用無機酸調節PH2-6來分析PI2550使用二乙烯苯—苯乙烯作填料，曾獲得專利。Cole和Dorsey研究過在反相分離梯度洗脫過程中二次平衡保留時間問題，他們發現當加入3％1-丙醇到強溶劑和弱溶劑中去時，二次平衡時間大大縮短。在反相分離過程中，曾有人作過三種研究關于分配過程中熱力學驅動力。Sentell和Henderson研究過C18相作為溫度和鍵合密度形狀選擇性并且發現低于室溫和高鍵合密度固定相可獲得較好的選擇性，他們建立了范德荷夫座標圖并且指出作為一種功能鍵合密度圖形的差異。
　　
　　Gheong和Carr曾使用對于烷基苯在水和4種普通的有機混合溶劑的一系列無限稀溶液的活度系數的混合物中，觀測其保留過程。他們注意到非極性溶質在飽和的十六烷甲醇溶液中和在純十六烷溶液中測得的活度系數稍微不同，表面積對鍵合的體積比率在鍵合相色譜中至關重要。
　　
　　Park等曾利用Kamlet-Tafl溶劑化色譜圖途徑來研究保留過程，他們測得氫鍵給體對甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈和四氫呋喃的水溶液的混合物的酸度進而研究單取代酚基于溶劑能量線性關系的保留值。聚合芳香烴的使用作為一種探測保留過程，尤其是對于相關的選擇性引起人們濃厚興趣。這些研究很成功，國際標準和技術協會已公布過這種標準參考材料作為評價反相柱的選擇性，其中有兩種觀點，Sander和Wise[8]發表過杰出的論文論述選擇性及其評價這種性質途徑。Hoffman和Chang報道過一些溶質溶解在弱極性溶劑中再注射到強極性流動相時峰高和塔板數的增加，vukamanic等注意到進樣溶劑的選擇能影響峰的完整性，包括產生裂峰和激變峰。已有各種各樣的途徑研究保留值和選擇性。有人曾連續使用同系物摸索選擇性，其它選擇性特征化的方法包括主要成分的分析和利用置換機理對于溶劑的模型吸附到鍵合相中熱力學處理。Kowalska也利用甲醇—水流動相調整溶質保留值，Kaibara等人則研究過反相固定相同溶質的反應，也有人[9]嘗試過利用UNIFAC法評價保留值，p－p鍵反應的作用，用不同的三元溶劑系統計算等強度的流動相，用溶質和流動相分配系數描述溶質保留值，用體積特性參數如粘度、介電常數等關系反相保留值，還有用信息理論和“負熵”描述保留行為。Skelly等開發計算機輔助選擇內標物，可從90種內標物的數據庫中依據保留時間的排列次序擇其所用。
　　
　　溶劑化顯色現象尤其利用Kamlet-Talf公式近年來成為探索色譜保留值時髦的工具。這可從最近連續的報道中可以看出。不管研究流動相還是固定相其氫鍵效應仍然非常重要。Carr研究小組[10]仔細地測量了甲醇、乙腈、2—丙醇和四氫呋喃(THF)水溶液混合物的氫鍵給體酸度并討論了相關的反相色譜保留值。Cheong和Choi[11]認為可以利用線性溶劑化能量關系預言保留值，為了獲得合理的關聯系數在保留值和溶質極性參數之間應排除強氫鍵力的溶質，他們假定可以利用在固定相上殘余氫氧根離子同這些化合物特殊的相互關系做到這點。Carr小組[12]另外也論述非常有價值的有關ET(30)溶劑強度的限度，他們指出如果在整個溶劑范圍內即從100％水到100％有機改良劑存在非線性化性，同時也應該再次強調，這也適合于別的單一參數溶劑，包括體積百分數對k’作圖和溶劑強度參數S。三元流動相組成溶劑的選擇性及特性也是人們感興趣的研究內容。Levin等[13]提出一種在二元流動相相關實驗基礎上預言三元流動相的保留行為。Dzido和Eegel-hardt研究了單取代極性官能團芳香族烴類化合物選擇性的變化，并且解釋了分子形狀大小、溶質和改良劑間的相互關系以及溶劑化絡合物在固定相中先后次序的變化。Heron和Tchapla[14]研究了非水介質反相LC的溶劑選擇，發現Kaelble三角圖比眾所周知的Snyder三角圖更為有效。
　　
　　各種各樣的研究有助于我們更好地理解流動相在保留過程中的作用。Chen和Pietrzyk表面選擇性、有效性、線性烷基苯磺酸的分離度能通過流動相離子強度和電解質陽離子的選擇得到提高。Busewski等[15]研究了流動相組成關于烷基胺相的保留值和選擇性的影響，Seibert和Poole應用一種溶劑化參數模型使丙腈硅烷固定相同甲醇、乙腈、2—丙醇和四氫呋喃流動相的保留性質特征化。流動相添加劑的研究也引起人們關注。McCrossen和Smpson研究戊腈和己腈作為流動相添加劑，發現加入少數的這類物質可引起保留值的明顯變化還能明顯改善有機胺的峰型。McCalley[16]研究有機溶劑強度對一些基本化合物的峰型影響，發現THF和甲醇比乙腈作流動相有更好的色譜峰，盡管不同溶質的行為有相當大的變化。
　　
　　Olesik研究小組的興趣也繼續集中在流動相的“增強流動性”上。當少量的二氧化碳加到傳統的反相色譜流動相時，其粘度減少，擴散系數增大，柱效提高。Lee和Olesik研究了結合升高溫度可進一步增大擴散系數和柱效，Cui和Olesik[17]報道過應用基礎化學對這些方法的改進，指出除了降低粘度外，二氧化碳也能破壞甲醇—水混合物的氫鍵。
　　
　　3液相色譜的檢測器
　　
　　液相色譜中檢測器是最脆弱的部分。八十年代初便有各種各樣的檢測器問世，但一般集中在高等院校和儀器公司里。有關檢測器應用的論文成千上萬。最流行的是可變波長檢測器，而固定波長檢測器由于適合用于大范圍的各種芳香化合物得到廣泛應用。折光指數檢測器，主要是應用空間排阻色譜在高分子工業以及食品和飲料工業中糖的檢測，由于工業界很少發表所測得的結果，其論文數相對較少。發展最迅速的是開變波長光電檢測器和電化學檢測器。依賴使用的檢測器合理檢測峰型或試樣純度，用柱前和柱后衍生化技術和別的新技術(如化學放大或激光源使用)獲得更多的信息。
　　
　　除了早期LC書籍中所涉及的檢測器外，還有許多現在HPLC檢測器方面的綜述[18]。隨著后來發展，毛細管液相色譜和毛細管電泳中使用敏感的吸收系數檢測器，其一途徑是論述了光照射晶軸得到明顯的改進，另一途徑論述了從吸附電解質到熒光物質增加到流動相中能量轉換，用連續的次級發射改進檢測限。Berthod論述了LC中激光檢測器的使用，他討論LC檢測器性能需要，相關激光性能，以及幾個激光—LC相結合的例子，包括光掃描、熒光、光電離子化、熱光離子化、折光率、光度和聲光檢測器。Dasgupta[19]引用170篇參考文獻論述柱后操作技術在離子色譜(IC)中改進選擇性和敏感度，Rochlin[20]引用36篇文獻比較不同類型的檢測器。
　　
　　液相色譜新的檢測技術不斷發展，以適應毛細管和微球柱大小的需要，Fielden論述了近幾年正在迅速發展的液相色譜檢測技術，并將其分成二大領域，即光譜和電化學檢測器，他也考慮到擴大柱后流動試劑檢測領域。據此，Freeman等論述了在液相色譜中生物化學柱后反應檢測技術，酶、蛋白質和抗體的使用從改進檢測器選擇性和敏感度角度討論。Martin等人論述了當今控制環境污染分析和監測方面面臨的挑戰，他們檢驗了多種分析技術，包括一些液相色譜儀，可以保證應用于控制環境污染問題，在相關的一篇綜述中，Chau評價了可以提供分析金屬離子的色譜技術，液相色譜技術同特殊元素檢測相結合，可以分離金屬絡合物結構，對于大氣、水、殘渣和魚樣的金屬離子分析具有重要意義。
　　
　　在近年來興起的DNA分析領域中，已有不少人報道評價聚合酶鏈反應產品的液相色譜分離和檢測中定量分析準確度和精密度。Gaus描述了由PCR允許的DNA放大技術準確定量，不需要放射性標記。在一項值得慶賀的研究中，Schmitt等論述了如何合同放大二極基因組的樣品作為內標物，在PCR基礎上，在各種細胞和組織中主要基因組樣品和成纖維細胞增長因子b的液相色譜分析。
　　
　　各種各樣檢測器的研究論文層出不窮，如紫外—可見光度檢測器，拉曼光譜檢測器，熒光檢測器，化學熒光檢測器，質譜檢測器，電化學檢測器，核磁共振檢測器以及光電二極管陣列檢測器等等。總之，檢測器的研究其共同的方向均朝著靈敏度高、重新性好、相應快、線性范圍寬、適應范圍廣、對流動相流量和溫度波動不敏感、死體積小等特性。